1553年，15岁的爱德华八世去世后，亨利八世的长女即爱德华和伊丽莎白的姐姐玛丽登上了王位。她是个虔诚的天主教徒，对罗马教皇怀着一颗赤诚的忠心。继位之后，就三番五次颁布法令，先后废除了爱德华六世时代以及亨利八世的一系列宗教改革措施。她把英格兰教会独立于教廷外，重新隶属于罗马教廷。更令人发指的是她又实行了一项暴虐措施，就是恢复使用人称“火刑柱”的刑具，并用这种刑具烧死大批新教领袖。她用血腥手段推行天主教。在她统治期间，英国新教徒遭到迫害，约有300人被处以死刑，更多的新教徒被迫背井离乡，逃亡到欧洲大陆避难。玛丽此举遭到了全国百姓的反对，被人们称为“血腥玛丽”。玛丽暴虐成性，为人乖张，时刻提防伊丽莎白以恢复新教信仰来号召人民。这时，托马斯·怀亚特爵士发动叛乱，公开打出废黜暴君、恢复新教的旗号。由于计划不周，被玛丽镇压下去。平叛以后，玛丽怀疑伊丽莎白是这场叛乱的幕后策划者。这时，西班牙王太子腓力正与玛丽女王商谈婚姻大事。这位太子是神圣罗马帝国皇帝查理五世的儿子。后来，他继承了西班牙王位，世称“腓力二世”。腓力也是一个心狠手辣的人，为了得到玛丽女王的王位，他催促玛丽尽早处死伊丽莎白。于是，玛丽以弑君的罪名将伊丽莎白投入伦敦塔囚禁起来。由于找不到叛逆罪的确凿证据，两个月后，伊丽莎白被转往远离伦敦的一处城堡中，言谈举止都在女王的监视之下。“血腥玛丽”只在英格兰统治了5年，于1558年11月17日病死。由于没留子嗣，她临终前极不情愿地确认伊丽莎白为王位继承人。伊丽莎白在钟声、爱国游行以及其他的群众庆祝活动中登上了王位。