达芬奇第二次回到故乡，无疑是佛罗伦萨市民们一件值得自豪的事情 。“圣安娜”展出时的空间盛况，人们还记忆犹新。他们现在更希望大艺术家达·芬奇能在自己的故乡留下一些具有纪念性的作品，借以装饰佛罗伦萨，也会给故乡带来光荣。
于是，佛罗伦萨元老院委托达芬奇，在市佛基奥宫“五百人”会议厅画一幅可资纪念的战役图。他们指定达芬奇画“安加利之战”。后来 ，当米开朗基罗完成了他在美术史上具有纪念碑意义的雕塑作品 “大卫”之时，元老院又别出心裁地聘请他在达·芬奇壁画的对面墙壁上画“卡西那之战”。
安加利之战发生于１４４０年，是佛罗伦萨贵族与伦巴底贵族之间进行的战争。战争的结果是佛罗伦萨人胜利，伦巴底人被打败了。卡西那之战发生于１ ３６４年，是佛罗伦萨人与比萨人的战争。结果是佛罗伦萨人取得胜利。两位艺术巨匠在故乡对相同题材展开壁画竞赛，被载入美术史册，成为千古佳话。
达芬奇经过长时间的构思和无数的准备草图后，决定描绘战争最紧张，也是最残酷的时刻——争夺军旗的战斗场面。画面中心是四个骑士为争夺一面军旗而厮杀。长旗杆已经折断，旗面也被撕破，但仍在一断杆尖头招展。五只手都抓住旗杆拼命抢夺。另一些手则挥舞刀剑，在空中相砍。马上的骑士张着大口，脸孔像他们的黄铜胸甲上的神话怪物嘴脸一样凶狠残暴地直立起来，前脚缠绕一起，眼睛发出怒火，张牙舞爪如同凶兽一样互相撕咬。马蹄下的血泊里，一个人揪着另一个人的头发，把他的脑袋往地上死命地砸。
达芬奇在这里表现的是“最野蛮最愚蠢行为”
的战争，揭露了战争中人的“兽性的疯狂”。画面上处于殊死搏斗中扭曲在一起的人体，彼此撕咬惊恐狂怒的战马，刀光剑影中的撕烂的军旗和折断的旗杆，以及由于撕杀而变形的人物脸孔，鲜明而生动地表现了这一主题，令人惊心动魄，具有非常的感染力。
米开朗基罗急急忙忙在会议厅里面画那幅《卡西那之战》，如同发疯一般，为了赶上他的敌手 。这对于他来说，并不是困难的。
他从那次与比萨人作战中选了一段故事。佛罗伦萨兵士，夏季某日在亚诺河洗浴，忽闻警报：敌人攻来了，兵士们急忙泅向岸边，从水里上来，——他们的疲倦身体刚下水去凉爽一下，——很忠心地着起了汗水淋漓和尘埃布满的衣服，披起了给太阳晒热的铜制的甲胄。
可见与达芬奇相反，米开朗基罗没有描绘最激烈的战争时刻。并非把战争画做无意义的互相残杀，画做“一切蠢事之中最兽性的 ”，而是描绘了战斗即将开始的时刻。画面上被描绘的是亚诺河上洗澡的士兵，突然听到军营中战斗的号角，他们从水中跑出来，急急忙忙穿衣准备应战，有的在岸上伸手拽水中的人，有的拼命往岸上爬。穿衣甲的，拿武器的，还有赤身裸体赶忙去应战的，各种各样的动作、姿态和表情，表明了一种紧张、匆忙然而是振奋、高涨的士气。同时，米开朗基罗在画中运用雄健、强壮的男性裸体，表现了豪迈慷慨的英雄主义气概。他在这里显示了一种强烈的英雄主义的主题。
达芬奇和米开朗基罗的草图公布之时的热烈场面，是可想而知的。这种比赛，佛罗伦萨人很留心地看着，好像群众有一场罕见的把戏时那般留心。但因与政治无关的一切事情，佛罗伦萨人都觉得平淡而无味，如同一盘菜当中没有放入香料和盐一样；所以他们急忙宣布：米开朗基罗是代表共和国反对梅狄奇家族的，达芬奇则是代表梅狄奇家族反对共和国的。
于是这个斗争就为大家所能了解，而具有新的力量了。
斗争到大街和广场上来，现在连那些对于艺术毫无兴趣的人也来参战。达芬奇和米开朗基罗的作品，成了敌对双方的战旗。
斗争发展下去 ，竟至于有人夜里拿石头去投掷 “大卫像”。没有一个人知道是谁投掷的。贵族说是平民做的，平民领袖说是贵族做的，当地艺术家们说是新迁在佛罗伦萨开设工场的佩鲁基诺那些徒弟做的；但邦那罗倜则在大执政的面前说 ：“拿石头投掷他的大卫像的那些流氓，一定是达芬奇收买来的 。”
好多人相信他的，或至少装做相信他的话。
有一天，达芬奇在替佐贡多夫人画像，画室里只有卓梵尼和沙莱诺两个徒弟在旁。话题谈到米开朗基罗，达芬奇便向丽莎夫人表白道：
“我相信，我若能同他对面谈一次话，一切就会自然消除的，这个完全无聊的争吵就可以消失得无影无踪。那时他可以明白，我并不是他的仇敌，而且世界上也没有人能比我更加爱他……”
丽莎夫人摇摇头：
“果真是这样么？达芬奇先生，他果真可以明白么？”
“他可以明白的，”艺术家很活泼地喊起来 。
“像他这样的人一定可以明白的！不幸的是：他如此胆怯，如此缺乏自信心。他心里着急，嫉妒，又害怕，因为他不认识他自己。那一切都是幻想出来的，都是发昏！我要告诉他一切，他就可以放心了。因为我有什么令他害怕呢？夫人，您知道，最近我看见了他的 ‘战士沐浴图’画稿，我几乎不敢相信我的眼睛！没有人想象得到他的艺术到了什么地步，将来又能达到什么地步。我知道，他今天不仅已经同我相匹敌了，甚至强过于我。是的，我觉得他是强过于我的……。”
达芬奇为想保存这幅《安加利之战》，仍然使用他认为比较可靠的特别的“油色”。工作完成一半时，他便在画前用盆燃起一把大火，试图让颜色更快地融入石灰之内。但是很快他就发现，热力只能及于图画下面部分，上面热力达不到的部分，漆和颜色并没有干。所以，甚至在壁画还没有完成之时，画面就开始坏了，现在所见到的，只是鲁本斯(１５７７—— １６４０)的摹本以及达芬奇为草图而准备的一些素描。因而只能见到其大致的面貌。
在绘制《安加利之战》的同时，达芬奇又在为另一个贵妇人画肖像，这就是后来在西方美术史上千古独步的不朽之作《蒙娜丽莎》。蒙娜丽莎据考是那波里芙，生于１４７９年，她的父亲本是一个有钱的贵族，但在１４９５年法国人入侵时破产了。达·芬奇给她画像时，她已是佛罗伦萨银行家和皮商人佛朗切斯柯·载尔·佐贡多的第三个妻子。１４８１年佐贡多先生娶过马里奥托·鲁色莱伊的女儿嘉美拉为妻，但结婚两年之后嘉美拉就死了 。以后他又娶了托马莎·维兰妮，不久又断弦了。第三次才娶了蒙娜丽莎小姐。
达芬奇为蒙娜丽莎画肖像时，艺术家已过了５ ０岁，丽莎夫人的丈夫才４５岁。佐贡多是一个谨慎和干练，不很坏，也不很好的人，致力于他的职务和田产。不久就做了首长。他把他年轻的美妻视为他家屋里的一件最适宜的装饰品，对蒙娜丽莎当然恩宠异常。但他懂得蒙娜丽莎夫人的美丽还不如他懂得西西利新种牛的优点或粗羊皮关税税率那般清楚哩。人家说，她并非为了爱嫁给他的，而是屈从父命；她的第一个追求者，自愿地在战场上战死了。又有人传说—也许是谣言——还有好多热烈的顽强的但都无望的追求她的人。但那些恶毒的口舌——在佛罗伦萨是不少的——对丽莎夫人都无坏话可说。她是恬静的，谦逊的，虔诚的，严谨遵守教会一切规则，施恩于穷人，会持家，忠实于她的丈夫，慈爱于她的丈夫的前妻留下的一个１２岁女儿狄安诺拉。
达芬奇对蒙娜丽莎夫人的肖像倾注了他最大的才能和热情。他在他的画室的院子中间设置了喷泉。
泉水落在半球形的玻璃上，发出轻微的音乐。喷泉周围他栽上了丽莎夫人喜爱的花。他还请来宫廷乐师、歌唱家、说书者、诗人和滑稽演员为蒙娜丽莎表演。
一方面是供她消遣，免得画像时她感到单调、无聊，另一方面他是趁机观察，音乐、故事和滑稽话在她心里引起的情感和思想活动，是怎样表现在她脸上，以便于他能够从容地捕捉表现在蒙娜丽莎脸上的内在情感。
达芬奇在他的《画论》中写道：
“要画肖像。你必须有个特别设备的画室：一个长方形的院子，１０米宽，２０米长，墙壁刷成黑色，突出的屋檐盖住一部分，还有一个遮阳布篷可以随需要而舒卷的。黄昏时候，或浮云多雾的天气底下，才卷起布篷画画。此时的光是最美满的 。”
达芬奇在佛罗伦萨的寓所就有这样一个画肖像用的院子。他的房东是佛罗伦萨高贵的公民，彼罗·狄·布拉楚·马特里先生——在政府执务，爱算学，聪明，且很敬重达芬奇。这寓所在马特里街上。
历经四个春秋，肖像画《蒙娜丽莎》完成了。画上的蒙娜丽莎坐在安乐椅上，双手交叠放在胸前，脸上露出勉强可以看出的微笑，像是微笑刚开始的一瞬间，也像是微笑结束的一瞬间。双手柔美、纤秀、富于表情，与她温柔、娴静、美丽的脸部表情相互呼应。
她的眼睛特具神彩，目光锐利而脉脉含情。薄如蝉翼的透明面纱，笼罩在蒙娜丽莎的头部与双肩，它把披肩上的两绺长发和肩部外衣的曲小的褶襞梳理成为统一、流畅的轮廓。袒露的胸部，显示了青春的女性美。
瓦萨里说过 ：“细看她脖子下面的凹处，仿佛可以看到血脉的搏动 。”在衣饰上，达芬奇在画面上又取消了一切华丽的装饰，但对胸襟和衣袖的褶襞作了精细的描写。衣纹自然逼真，表现了软缎的轻软光亮的质感。达芬奇根据当时的社会风尚，女子因好广额，将眉刮去，所以他没有给蒙娜丽莎画眉毛。这又使得画中人物增添了一种大理石雕塑的意味。
达芬奇在这幅画中表现出来的精彩绝伦的技巧，无疑达到了登峰造极的地步。画上的一切都是清晰而准确的，连同衣服的微小皱纹，围绕雪白胸膛的黑色花边，都画得可以乱真。同时，达芬奇在蒙娜丽莎的脸部、胸部和手部，使用了他所特有的“明暗转移法 ”，用他喜欢的薄暗的光，使蒙娜丽莎脸上和手上仿佛罩着一层黄昏时的光影，显示出柔和而富于诗意的调子。在背景处理上，达芬奇用左右两边隐约可以看出圆柱的基础和石栏，把近景和远景区分开来。
他使用“空气透视法”将远景推向无限深远之处。那些古老的岩石，天蓝色的钟乳般的山峰，还有在岩石中间蜿蜒流淌着的河流，这一切仿佛笼罩在模糊的薄雾里，然后消失在无限深远的青色的云海中。这个背景把蒙娜丽莎的形体从观看者的位置拉向遥远的地方，从而使画中人物更富有审美的魅力。
达芬奇认为人是最神圣的。人体是自然界中最美的形象。他曾反复多次地测量证明，人体各部分之间的比例都是整数比，因此人体呈现出最为和谐的美，称之为“神圣的比例”。他说：
“谁不尊重生命，谁就不配享有生命 。”
《蒙娜丽莎》正是他以一个真实的女性的微笑歌颂着人自身的美丽，呼唤着人性的觉醒，颂扬生命的可爱之处。体现了他的人生哲理。
《蒙娜丽莎》的右手被誉为是世界美术史上最美的一只手。尽管科学发达的现代摄影技术无比高超，但如果把这只手与现代摄影作品相比，人们仍可以看出这只手更有体积感，更有重量，更有生命力。几乎完全临空的中指指缝隙中，人们似乎能听到音乐的美妙，感觉到蒙娜丽莎那瞬间的愉快。现代摄影是很难记录下这种内在的神韵的。
１６世纪初的许多画家往往把精力放在形体正确、轮廓严密、线条准确、细节清晰上，结果在他们笔下的形象往往缺乏生气。出现了僵化的“睡美人 ”，只有达芬奇，才把生动性提到了更高的境界；并创造了众多充满活力的形象。
然而，自《蒙娜丽莎》问世以来，人们对之赞叹不已而又争论不休的，则是蒙娜丽莎的“神秘微笑”。
究竟什么是蒙娜丽莎“神秘微笑”的原因？她微笑的含义是什么？有人说这是“魅惑的微笑 ”，有人说是 “邪气的微笑 ”，有人则认为是不可理解的神秘的微笑，是一个永恒之谜。其实，从画面上看到的蒙娜丽莎的微笑，是一种心安理得的自信和乐观从容的气度。
而这一点，正是那个经过漫长的中世纪的黑暗，人们正从基督教神学的重压下觉醒过来，去追求新生活的时代特征。画中的蒙娜丽莎，从微笑中不仅显示出她的温雅、高尚和愉快，也显示出对新世界和新生活的欢欣和喜悦。这里没有丝毫的怀疑和恐惧，没有中世纪画家笔下人物的呆板、僵冷和对世界充满恐惧的踪影。也不像中世纪画像中那种作为神的奴仆的毫无生机的人，蒙娜丽莎是一个充满着青春和生命力的有血有肉的形象。达芬奇用他的“蒙娜丽莎 ”，展示了那个伟大时代的人们新的精神风貌，揭示了人们对新生活的向往、乐观与自信。同时，也表达了他对解脱神的枷锁后的人以及人的美的热情赞颂。蒙娜丽莎的微笑，使这一人物形象具有了无限深广的意境。无论是其自身的和谐的诗意，还是其深厚广博的社会学、历史学涵义，都达到了无与伦比的高度。从这一点来说，蒙娜丽莎的微笑也是一曲千古绝唱。在蒙娜丽莎的身上，理性的原则和高度的诗意，崇高的精神和生动的肉体，情感和理智、科学和艺术，都和谐而完美地统一于一身。这正是文艺复兴时期人的完整的形象。
是人类历史进程中出现的一个全面发展的杰出范例。
《蒙娜丽莎》表现了时代的巨大思想蕴含和艺术造诣的惊人深度，因而几个世纪以来，人们对它永恒的魅力怀有持续不减的热情。
达芬奇画成这幅画后，一直带在身边，视为珍藏品。直到他死后，才为法兰西国王弗朗西斯一世所收藏。现在这幅画珍藏于巴黎卢浮宫博物馆。
在达芬奇画《蒙娜丽莎》的期间，他的父亲彼埃罗·达芬奇于１５０４年７月７日去世了。彼埃罗先生活了８０岁，可谓长乐长福，享尽天年。他身后有１０个儿子和两个女儿。彼埃罗先生生前多次说过，他的非婚生长子列奥纳多·达芬奇，同他的其他儿子一样，可以继承他的遗产。可是，等到彼埃罗先生去世时，达芬奇的异母弟弟们宣布：他们的哥哥是父亲的私生子，对于遗产没有权利继承。
正当达芬奇束手无策的时候，有个放重利的人，一个狡猾的犹太人，曾因他有得到遗产希望而借钱给他的，便向他提议购买他同弟弟们争夺的权利。达·芬奇虽然厌恶家务纠纷和诉讼带来数不清的烦恼，平时对这一类事情避之唯恐不及，但是那时他的经济景况如此枯窘，不得已答应了犹太人。于是开始了诉议，争３００个弗罗□财产，官司延续了六年之久。他的弟弟们利用一般人对于达芬奇的不满，火上添油，攻击其不信上帝，在凯撒底下做事时出卖祖国，行巫术，发掘死尸来解剖，亵渎基督教坟墓；他们也重提那２５年前已经止息的关于他的反叛自然的罪孽的传闻，而且侮辱他的已经逝世的母亲卡德琳娜；并添油加醋，提出有关于达芬奇同性恋的指控；更加卑鄙的是，散布流言蜚语，利用一般人对科学的无知或误解攻击达芬奇的一切著作。
除了遗产继承上的纠纷，达芬奇还有其他很多不愉快的事情。他与米开朗基罗之间的误解越来越深。
在佛罗伦萨市政会议厅展开的壁画竞赛就是比他年轻 ２３岁的米开朗基罗出来公开与他挑战的行为。而他们壁画的草图展出后，又在佛罗伦萨市民中引起争议；有人说《安加利之战》高于《卡西那之战》；有人则持相反的看法。事情发展的结果，竟导致有人在夜间拿出石头去投米开朗基罗的“大卫像”。而米开朗基罗则一口咬定这些流氓的所为是达芬奇收买，并指使他们干的。这使达芬奇有口难辩，十分难堪。
此外，身为当时著名政治家的佛罗伦萨终身大执政的彼埃罗·索德里尼，与达芬奇也是话不投机。
他经常暗示达芬奇曾为斯福查和凯撒·波尔查绘过佛罗伦萨周围的军用地图，这无疑是有叛国嫌疑的。
他希望达芬奇能有一种忏悔的精神替他的政府服务。
他还用讥讽的语调来评论达芬奇的《安加利之战》。
甚至在达芬奇领出的一笔工作费用的款项上，他都认为是贪污行为。
故乡对于达芬奇来说，已是非留之地也。他觉得难以在这里继续生活和工作下去。于是，经过米兰的法国总督查理·达·安波斯的请求，佛罗伦萨的执政们允许达芬奇请三个月的假。
在春天的时候，去米兰一行。同２５年前一样，他又带着一种愉快的心情离开故乡佛罗伦萨，奔赴米兰。