１５０６年５月，达芬奇二度来到米兰。他是以请假的办法离开佛罗伦萨的。假期原是三个月，但经过法兰西国王和他的兰米总督查理·达·安波斯的说情，佛罗伦萨执政府准许达芬奇无限期请假。第二年，即１５０７年，达芬奇应法国国王路易十二的聘请，正式任米兰宫廷画家和技师。他便搬到米兰长住下来，偶然有事情才去佛罗伦萨走一趟。
作为宫廷技师，达芬奇仍然作一些水利工程的设计工作。同时，他还为法国总督布置米兰要塞工事，建筑营寨，以防德伦巴第人的进攻，就像当年他替米兰公爵斯福查布置工事以防备法国人进攻一样。也为法国人搭凯旋门，这些材料同样也为斯福查用过。政治是达芬奇从来不感兴趣的，他只是对他的工作本身感兴趣。
在从事这些工程技术之作之处，达芬奇仍然没有中止他的艺术创作。大约在１５０６年间，他创作了油画《丽达和天鹅》。这幅画取材于希腊神话故事。
丽达是一位仙女。她孤身一人居住在一个荒岛上。
这里风景优美，但是人迹罕至，她感到非常孤独、寂寞。排遣寂寞的唯一办法，就是躺在绿荫之下，仰天观云。看云飞云散，变幻莫测，觉得自得其乐。一天，她看到天边突然飞来一朵闪光的祥云，落到面前，原来是一只晶莹洁白的天鹅。这是一只优美、健壮的天鹅。它走向丽达，依偎着她。丽达也非常喜欢这只天鹅。可是，这位少女当时怎么也想不到，这只天鹅是宙斯变的。
后来他们相爱，丽达怀孕生下了一个大鹅蛋，破壳而出的是两个男孩。达芬奇画中描绘的是丽达和天鹅相会的情景。
画中背景是蓝天下的河流湖泊，群山环绕，画的右边是一株大树。前景是裸体的丽达和矫健的天鹅。
丽达带着少女初恋时的喜悦和羞怯，她的裸体展示了青春的美丽和生命力。画面左下角有一对白胖的幼儿在天真嬉戏，抢夺手中的鲜花。整个画面生机勃勃，情趣盎然。它表达了艺术家对自然的赞美，对追求爱与美的美好人生的颂扬。
“丽达与天鹅”是西方古代神奇的爱情故事中为人们所喜爱与传颂的一个。众神之王宙斯由于地位至高无上而目空一切，生活作风自由而放荡，他为了追求爱情的满足不知变幻过多少形象而与神间、人间的美丽女子相爱。现在他又爱上了仙女丽达。丽达生活在美丽的海岛上，她那绝代之美放射出灿烂的光辉，这使宙斯在奥林匹斯山上情火燃烧，坐立不安，但是天后赫拉对他看管极严，使他无法脱身，最后他巧妙地摆脱了妻子的监视，摇身一变成为天鹅，飞落在丽达的身边。天真的丽达根本不知道这是宙斯的化身，十分喜欢这只雄健温顺的大天鹅，他们俩成了形影相随的亲密朋友。
文艺复兴时期，人们从否定人性的中世纪桎梏下醒悟过来，大胆地追求人类之爱与个性解放，画家给这一神话传说赋予了新的时代精神。画家们争相描绘古希腊的情爱神话故事，借以表达自己的情感和审美理想。
希腊人创造了这一美好的神话，表达了古代人们对爱的渴望与追求。人类的延续正是爱情的结果，这故事的产生表明希腊人对人类这一本性的肯定和赞颂。
达芬奇在１５０４年到１５０６年间至少完成了三幅《丽达与天鹅》的构图。达芬奇的画可以从两个方面看，一是从科学家的角度看芬奇是如何利用画来表明自己的科学见解的；二是从艺术家的角度看他是如何通过艺术形象传达情感的。根据达芬奇没有受到古典神话的感动，对新柏拉图主义也不怎么关心，尤其是在感情上或肉欲上，女人对他没有什么吸引力。这正是决定他创作动机的因素。既然女人引不起他的欲望，他对传种接代的神秘性当然就愈发好奇了，这就激起他对人类的繁殖现象进行研究的欲望，所以在他的艺术中包含着科学探索的一面。
人们曾发现”丽达”一画是作为他研究人的生殖过程中的草图，至少他只想把这幅画作为生殖的意象或寓言。在达芬奇的有关《丽达与天鹅》的三幅构图中，立体形象基本上是相同的，只是配置了不相同的环境。
比如，其中的一幅是这样的：
在一片宁静的散满奇花异草的山水间，一位裸露玉体似仙似人的女子，婀娜多姿地面含羞涩的微笑，在和一只巨大的天鹅玩耍，足边两个小天使摘取一束鲜花，奉献于这女子——女神丽达。画家特意将丽达画得“顶天立地 ”，依偎着求爱的天鹅，含情脉脉，显示出一个少女的腼腆。少女搂抱着天鹅的颈项，曲伸的鹅头欲与仙女亲吻。天鹅张开强有力的右翅，温柔地拢抱着少女那令人失魂的玉体，很有节制地献上爱的深情。
大自然在为他们的幸福微笑，小鸟也在为他们相爱而歌唱，鲜花为他们盛开，自然充满更新的生机，这是获得新生时代的赞歌，对人类性爱的颂扬。
达芬奇着力于描绘爱的柔情蜜意，在人物与天鹅的造型上，强调曲线的构成。我们从丽达的身姿上不难看出普列特西克里斯的S形优美造型的光辉，其雕刻般的造型结构，充分利用面的转折以使主体人物形象丰富：丽达下身呈正面，上身侧转，这种变化使直立单调的体形顿觉丰富。达芬奇在造型处理上为了充分表达温柔与智慧之美，采取明暗渐进的处理法，这是他从画鸡蛋的明暗法中悟出的真谛。光芒照在丽达身上变化柔和，这适合于女子人体圆浑丰满的造型，明暗色调变化层次也极为丰富。不太过份的受光面是主调，最暗处放在明与暗交界处，这种形体处理产生了强烈的立体感、真实空间感，有一种雕塑般的效果，柔中有力。但画家尚未做到色彩的微妙变化，但却十分讲究大块的热冷对比关系，人物用热色主宰，而大面积的背景却以冷暗色调相衬，这就使人体更鲜明突出。达芬奇在背景的描绘上赋予了自然以生机，细致地描绘了繁多的自然物，各种不同的花草树木、桥梁、建筑，既显示了神的奥秘境界又反映了人的生活环境。画家把对人的赞美、对自然的赞美融于一画。
达芬奇在他的艺术创作中，渴望探知人类灵魂和肉体的奥秘。并把这种探求再现于人们的视觉之中；他企图对自然的伟大进行悉心研究并把它的美再现于人们的眼前。他做到了，比任何人做得都好，尽善尽美。
渴望是甜蜜的，但满足却是痛苦的 ，“完美的天赋必然伴随着巨大的痛苦”。对于达芬奇这样一位艺术大师而言，尤其如此。创造美的能力越大，感受痛苦的敏感益甚。这位艺术大师之所以成就卓著，那是因为他备受磨难。古希腊诗人有一个观念，它建立在对生活的深刻理解之上。那就是“磨难出智慧”
——正是因为我们能吃苦，所以我们才能创造。
与此同时，达芬奇还设计伦巴底的征服者、法国元帅特里乌尔齐奥的骑马纪念碑。他采用前足跳起，后足站立的马的构图。从他的弟子们所作的青铜模型来看，这一构图具有强烈的运动感与表现力。
达芬奇这期间创作的比较重要的油画是《圣安娜》和《施洗约翰》。油画《圣安娜》与１５０１年的素描《圣安娜》构图大致相似。但施洗小约翰被取消了，马利亚坐在她母亲的膝上，圣安娜以微笑注视耶酥，耶稣则企图骑在羔羊的身上。圣安娜好像永远是年轻的古代女先如。她的下垂的眼睛和微颤的嘴唇之间露出笑容，是神秘而慈爱的。马利亚在母亲的身上，表现出孩子般的天真。画面上仍然洋溢着圣家族生活的天伦之乐。
但是，与素描比较起来，圣安娜与马利亚脸上的笑容丧失了它以前的深刻的表现力。而且整体上，也不如素描自然生动，富有诗意。
《施洗约翰》中画的约翰，一只手擎着十字架，另一只手指向天空。他面带微笑，头发很长，气质上带有女性的温柔。这种微笑，表明达芬奇的创作已有定型化的倾向。这标志着达·芬进入老年，他的艺术创作的才华，正在逐渐减退。
然而，已近暮年的达芬奇，在１５１２年作的素描《自画像》，给他一生的艺术创作生涯划了一个辉煌的句号。
从现在传世的作品和资料来看 ，《自画像》大约是达芬奇的封笔之作，画上的达芬奇蓄着浓密的长须，目光深邃、犀利，额头和眼角皱纹纵横，显出阅尽人间沧桑的经历和丰富的智慧，端直的鼻子下面，嘴角刚毅而有力。他的脸上流露出沉思和仿佛痛苦的表情，揭示他的全部的个人命运，也烙下了那个时代的印记。
素描运用的是红炭笔，线条流畅、有力，具有激动人心的表现力。它没有为细节淹没，也没有回避细节，而是详尽无遗地表现了人物的本质特征。线条不仅仅描绘一形象的轮廓，还具有一定的空间立体品质，创造了生动的造型体积感受，达到浮雕式的造型效果。
有人曾这样评论 ：“人们从这幅自画像里，可以看出巨匠的思考力、智慧和性格的特征。人们可以看到具有坚强不屈的意志的鼻梁和嘴唇，洞察一切事物的敏锐而深刻的眼睛。波浪式的长发连结着下须，掩盖着深思而庄严的脸，给人留下一个具有无限生命力的伟大师匠的印象 。”
此时，达芬奇的主要精力和时间投入在数学、生理学和解剖学等科学研究中。
达芬奇第一次住在米兰替穆罗办事时，很勤勉研究解剖学；同他一起研究的，还有个很年轻的科学家，马可·安东尼阿，那时只有１８岁，但已经是个有名的学者了 。马可·安东尼阿是卫隆那旧世家德拉·托勒族出身，这一族人历来都爱研究学问；他的父亲在巴杜亚大学教医学，他的几个哥哥也是学者。
他差不多还是一个小孩子时，意大利两个有名的大学，巴杜亚大学和巴维亚大学，都争着聘用他，达芬奇回到米兰之前，马可·安东尼阿也才２ ５岁，但已经是全欧洲第一等的学者了。
这两个人研究学问的方向似乎是一致的：都舍弃中古阿拉伯人那种经院式的解剖学而代之以实验和观察，代之以精密研究活体的构造。但在表面相同之下，却藏有深刻的差异。
艺术家感到有个秘密存在于知识的最后限界；这秘密透过一切自然现象吸引了他，如同磁石透过布帛吸铁一般。他描写肩头筋肉时说道 ：“这些筋肉，仅仅以其细丝的尖端附着于骨骼的最外边缘 ：‘大师’如此安排，使得这些筋肉能够随着需要自由开展和紧缩，变长和变短 。”如此看来，一切知识的结果，都引导人去大大地钦佩那不可探究的事物。
马可·安东尼阿也感到自然现象之中有秘密。但他不肯在此秘密面前谦卑屈服。他又不能排除它或克服它，只好同它作战而且惧怕它了。达芬奇的科学引到上帝去——马可·安东尼阿的科学则反对上帝，他要用一种新信仰，对于人类理性的信仰，去代替那业已丧失的信仰。
达芬奇认为，画家必须了解人体的内部构造。
因为画家要表现人物的身姿手势时，使各部位恰当妥贴，他就必须了解筋、骨、肌肉、腱的解剖，了解每一种运动是由哪一条肌肉或腱引起的。这样在作画时，把这些起作用的肌肉或腱画得粗壮些，其余的肌肉就不必画得条条毕露了。有些画家不懂解剖，他们笔下的人物裸体像一袋核桃，而上面的肌肉，则像一根根萝卜。
为了准确而有生气地描绘人体，达芬奇亲自解剖了几十具尸体。把各种器官加以分解，把包围这些血管的纵使是最细微的肉屑也剔除干净。这是一项非常艰苦、细致而又需要知识和耐心的工作。即使你对科学有兴趣，你也可能会被那天然的臭气弄得退避三舍；如果这没有束缚你，你或许也会害怕在晚上摆弄这被肢解的、剥了皮的死尸；如果这挡阻你，你还可能缺少在这种再现原状的工作中不可缺少的素描技巧；即使你有这技巧，也可能没和透视学的知识相结合；就算是结合了，你也不可能不通晓几何学的证明方法或是衡量肌肉的力量和强度的方法……”
通过对人体的解剖，达芬奇精确地了解了人体的骨骼、肌肉、关节以及内脏器官的结构。他画的人体解剖图，不但细致准确，而且还是出色的艺术品。
此外达芬奇还得出许多医学的、生理学的科学结论。对医学和生理学等作出一系列贡献。他是第一位精确绘制开放着的子宫图像的人；他发现了血液对人体起着新陈代谢的作用，认为血液不断地改造全身，把养料带到身体需要的各个部分，然后把废料带走，像一座火炉，既要添柴，又要除炭；他还发现心脏有四个腔，并画出了心脏瓣膜。他把人的心脏看成是人体的血流压机，并认为血液循环与水的流转相似，脉搏和心跳是一致的；因此，他断言老年人死因之一是动脉硬化，这是缺乏运动而产生的结果。这个理论，一个世纪后为英国人威廉·哈维所证实并发展。
达芬奇还首创用蜡来表现人脑的内部结构，并第一个设想用玻璃和陶瓷制作心脏和眼睛活动模型。
达芬奇还把人的生理构造及特征与动物的进行比较。他发现人类的身体构造不仅同四足兽相似，而且同鱼和鸟也相似。例如，人的内脏与猴、狮、牛、鱼、鸟等的内脏，人的手指头与熊掌的指头、鱼鳍的软骨、鸟翼和蝙蝠翼的骨架等，都有相似之处。
在这里，达芬奇看到一个统一的无所不包的自然法则。像文艺复兴时期的人们所普遍认为的那样，达芬奇也把人看作是“小宇宙”。他按照托勒密在他的《宇宙志》中采用的顺序，用１５幅人体解剖图揭示“小宇宙”的秘密。如同托勒密把大宇宙划分成各个区域一样，他也把人体分解为各部分，从各个方向确定每一部分的功能，并用人体图表示人的局部运动的能力。而人的运动的原因及其规律，则又是机械学研究的对象。他认为人类和动物的肢体是活动的杠杆。因此 ，一切知识都根源于机械学 。机械学乃是 “最初推动者的奇妙正义之化身”。“最初制造师”的行善意志，正是从“最初推动者”的公平意志产生出来的。这是一切秘密的核心。
人要深入了解人体的运动及其规律，就必须要从机械学了解人和动物的运动和力的法则。依靠机械学的帮助，能够以几何学的准确度来证明解剖学的每一条定理。
尽管达芬奇对人的骨骼、肉体了如指掌，对人体的美妙动人心领神会，但他仍然认为，灵魂比肉体更美。人的肉体的构造固然是很美满的，但拿来同住在其中的灵魂相比，就大为逊色了。因为灵魂总是神性的。有灵魂的肉体就是活的生命。
灵魂是不肯同肉体分开的。所以最美的是生命。
“生命是如此美丽，凡不尊重生命的人是不配有生命的 。”
这就是达芬奇之所以憎恶战争，反对杀戮的最根本的思想根源。王公贵族们为了无聊的荣誉和权力你争我夺，不择手段，常常使他感到可笑。野心是徒劳的，在名利的角逐中，枉送了别人的生命，也枉送了自己的生命，是最愚蠢的行为。他的那些保护人们，力求精通能使自己高贵起来的艺术。而达芬奇则致力于探索艺术的高贵。生命是美好的，而只有在美中，他才对生命感到心满意足，其余的一切都是长在虚幻树上的不切合实际的果实，是无意义的。
达芬奇是以在路易十二手下供职而居住在米兰的。但是，他没有固定的俸禄。经济上完全随国王陛下恩意赏赐。可是，深居王宫而又成天被大臣、将军和夫人们包围的国王，时常把他给忘记了。而他又不会以他的作品取得国王的欢心，引起国王的注意，更不会阿谀奉承，在国王周围周旋。
相反，他的工作一年比一年更少，也更迟缓了。
于是，同以前一样，他总在闹穷，借债。只要能借到钱的地方，他都会去借。甚至向自己的徒弟借钱。还钱的期限到了，他又借新债来偿还旧债。不得已时，他也写信给米兰的法国总督查理·达·安波斯以及手下的度支官，吱吱唔唔地讨要薪俸 ：“并非存心麻烦大人，实在不能不敬问一声：我的薪俸能发给我么？我不止一次上呈大人了，但至今未得回答……”信呈上去之后，他耐心地等待大人们的回音，可是这种等待十有九空。
达芬奇觉得，替王侯做事的时候，同替民众做事的时候一样，被人视为多余，——无论何时何处他都成了一个陌生的人。
三年之后，教皇朱留士、皇帝马可西米良第一和西班牙国王费迪南结成“神圣同盟 ”，把法国人赶出伦巴底去了；而且依靠瑞士雇佣兵的帮助，把罗督维科·斯福查的儿子马西米良诺，即所谓“小穆罗”的，召回做公爵，——新公爵是在皇帝宫廷长大的一个１ ９岁的少年人。
达芬奇也搭了一个凯旋门欢迎他。
小穆罗的公位坐不稳当。那些瑞士雇佣兵士太不关心他，把他当作无足轻重的傀儡；反之，神圣同盟那些人物又太关心他了。青年公爵小穆罗无心顾及艺术，但他还是聘请了达芬奇，任宫廷画师，定了薪俸数额，但始终没有付过。
此时，托斯堪那也发生了变乱，同伦巴底一样。
代表天意的民意，以及费迪南王的大炮，推翻了那个可怜的彼埃罗·索德里尼先生。他对公民们的共和德行，完全绝望了，只好逃到辣古沙去。过去的暴君，豪华者罗棱慈诸子，梅狄奇家兄弟们，回到佛罗伦萨来了。其中一个名叫朱良诺的，是一个奇异的梦想家，对于权力和荣誉都很冷淡，是个忧郁的怪人，爱好炼金术。嘉黎屋托·萨克罗布斯果先生从米兰逃出来后，就在他那里避难，告诉了他奇奇怪怪的关于达芬奇有什么秘密智慧的话。这位朱良诺·德·梅狄奇，在复国之后，便来聘请达芬奇，并非把他看做艺术家，而是把他看做炼金士的。
此时，达芬奇的徒弟凯撒暗中同拉斐尔通信， ——当时，拉斐尔在罗马，在教皇朱留士第二那里，替梵蒂冈宫内厅堂画壁画。已经有好多人作预言，说：
达芬奇的声名，在这颗新星光芒之中，要黯然失色了。师父有几好次确实觉得，凯撒存心要背叛他。
但友人的忠实比敌人的背叛，还更糟些。
伦巴底有一部分青年画家在米兰形成了一个学派，自称为“达芬奇学派 ”，其中有些是他以前的徒弟，此外则都是新人物，多至不可胜数，而且一天比一天多，——他们拥挤在他的周围，都自以为是跟随他的足迹走，对人家也是这样说。
达芬奇对于这些所谓友人的纷纷扰扰，毫不感兴趣；这些人自己也不明白他们做些什么。有时，他感觉到一阵恶心，当他看见他生平视为神圣的和伟大的，如今给俗人拿去玩弄时 ：《最后的晚餐》中耶稣的面容被人描摹去了，同教会的庸俗观念结合一起；蒙娜丽莎的微笑也被人描成了淫荡的，或者纠缠到什么“柏拉图式恋爱”的幻想中去。
１５１２年冬天，马可·安东尼阿·德拉·托勒死于加达湖边一个小城黎瓦狄特棱托；他在那里替穷人医疟疾，不幸自己受了传染。他死时才有３０岁。
他一死，达芬奇更加感觉孤独了。马可·安东尼阿虽然不与艺术家完全同心，却比别人更接近些。
现在，老年的阴影降临于他的生命时，达芬奇觉得，凡联系他与活人世界的一切线索都先后剪断了，他的周围，孤独和寂寞一天天扩大，他好像是沿着一条狭窄而黑暗的小径深入地底下，而且拿铁铲在岩石中间开掘一条道路，孜孜不倦地开掘着，始终希望能在地底下掘出一条路通到新的天上去的，——这希望也许是妄想。
冬天某夜，他孤独一个人坐在他的房间内，似听着寒风怒吼，恰如丽莎夫人死的那年冬天夜里一样。
夜风的不祥声音说着人心了解的事情，说着熟悉的不可转移的事情，说着混沌父怀抱里可怕的盲目的黑暗之中最后的孤独，说着人世的无限的凄凉。
他想起了死，近来他时常想起了死，而且每次都要联想到蒙娜·丽莎。
忽然有人敲门，他起来开了门。
一个不认识的少年人走进房里来：眼睛温柔而活泼，面孔冻得通红，深金色的鬈发沾满了雪花。
“达芬奇先生！”少年人喊道 ，“您不认得我么？”
达芬奇仔细看着他，认出了这是他的小朋友弗朗西斯果·默尔齐，某年春天曾同他一道在瓦卜里奥附近林子里游玩的。那时，这个少年人才８岁呢。
艺术家以父性的慈爱抱吻了他。
弗朗西斯果说他现在从波伦拿来，１５００年法国人攻陷伦巴底之后不久，他的父亲就搬家到波伦拿去了，因为他不愿看见故国的耻辱和苦难。他的父亲害了好多年的重病，不久之前才去世。他自己现在赶到达芬奇这里来，是要画师收他为徒。
１５１５年初，法国军队又卷土重来，向米兰进军。仗·查谷谟·特里武佐元帅，同些瑞士雇佣兵谈判，要他们交出小穆罗，这个小青年公爵岌岌可危，要陷于他父亲的命运中了。达芬奇预见到伦巴底又有变乱发生了。
最近几年来，他厌倦于那种变幻无常的政治了，厌倦于替人搭凯旋门，替人修理天使翅膀上破损的发条了。他时常对自己说：这些天使和他一样，现在该是安息的时候了。
他决定离开米兰，替梅狄奇家办事去。
不久教皇朱留士第二死了。梅狄奇家族中的乔凡尼·德·梅狄奇，被选为新教皇，称为利奥第十。这位新教皇任命他的兄弟朱良诺为罗马教会护教大将军，即是当初凯撒·波尔查的官职，朱良诺于是到罗马走马上任。他让达芬奇秋天也要到罗马去供职。
达芬奇离开米兰前几天，布洛列托广场上焚烧 １３９个男巫和女巫。第二天，黎明时分，圣方济谷修道院那些修士发现了达芬奇的徒弟卓梵尼·贝尔特拉非奥不省人事，倒在本涅德托修士房里的地板之上。他显然又发了那种１５年前的病症：死人一般冰冷的面孔上，不动情的眼睛里面，有时露出一种神气。
比１５年前更加令达芬奇担忧。
师父希望，徒弟若能离开他的”恶眼”就可得救；所以他要卓梵尼在米兰本涅德修士处养病，不要跟他去罗马。但卓梵尼如此固执地请求同去，使他不忍心再拒绝了。
法国大军快到米兰了。民众之中起了骚乱。小穆罗幼稚而固执，非灭亡不可，再不能延缓了。达·芬奇厌倦地无可奈何地，走着他这个无家可归、没有希望的行程。
１５１３年９月２３日，达芬奇怀着暗淡而又茫然的心情，带领几个徒弟：弗朗西斯果·默尔齐、沙莱诺、凯撒、左罗亚斯特罗和卓梵尼，从米兰动身往罗马去。从此他离开这块辛勤奔波的奋斗多年的热土，再也没有回来。